不同復(fù)溫方法對(duì)液氮保存人同種瓣活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

目的：尋找一種能最大程度保持液氮貯存人同種主動(dòng)脈瓣活性的復(fù)溫方法。自增壓液氮罐
方法：同種主動(dòng)脈瓣(n=36)隨機(jī)分為6組，Ⅰ組為新鮮同種主動(dòng)脈瓣，Ⅱ～Ⅵ組經(jīng)液氮保存3月后，分別采用①42℃水浴復(fù)溫(Ⅱ組)，②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組)，③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組)，④(10.0±2.0)℃/min(Ⅴ組)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)。將同種主動(dòng)脈瓣復(fù)溫至4℃，對(duì)所有同種主動(dòng)脈瓣進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)、24小時(shí)葡萄糖代謝率測(cè)定，氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入、瓣膜組織培養(yǎng)。
結(jié)果：上述指標(biāo)Ⅰ組顯著優(yōu)于其余各組(P＜0.05)，Ⅳ組優(yōu)于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)。組織培養(yǎng)Ⅰ組細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)于其余各組，且早于各組3～4天。
結(jié)論：不同復(fù)溫方法對(duì)同種主動(dòng)脈瓣活性影響不同，以4℃/min勻速?gòu)?fù)溫法對(duì)同種主動(dòng)脈瓣活性影響最輕。

關(guān)鍵詞：同種 主動(dòng)脈瓣 活性

　　我們通過(guò)本研究觀察不同復(fù)溫方法對(duì)同種瓣活性的影響，旨在尋找一種能較好保持同種瓣活性的復(fù)溫方法，為臨床合理應(yīng)用同種瓣提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法
　　1.取材分組　于1995年10月～1996年5月選擇46例健康成人腦死亡者，于死亡30分鐘內(nèi)，在無(wú)菌條件下取出心臟，隨機(jī)抽取36例(年齡20歲～32歲，平均26歲)分為6組(n=36)。4℃生理鹽水
沖洗、修剪，保留主動(dòng)脈瓣，插入銅-康銅熱電偶測(cè)量電極，將同種瓣置入含萬(wàn)古霉素(50mg/L)、二性霉素(25mg/L)的RPMI1640液，經(jīng)4℃過(guò)渡2小時(shí)后移入液氮?dú)庀嘀蟹胖?小時(shí)，然后置入液氮中，保存3月后取出，分別以①42℃水浴復(fù)溫(Ⅱ組)；②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組)；③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組)；④(10.0±2.0)/min(Ⅴ組)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)的速率將同種瓣復(fù)溫至4℃，新鮮未冷凍同種瓣對(duì)照(Ⅰ組)。
　　2.溫度測(cè)量控制裝置與方法　根據(jù)升降式降溫儀原理，自制復(fù)溫裝置，如圖1所示。

圖1　升降式溫度測(cè)量控制裝置
1　液氮容器　2　銅-康銅熱電偶
3　同種瓣保存袋　4　液氮　5　旋轉(zhuǎn)升降器　6　冰瓶
7　植物油　8　標(biāo)準(zhǔn)探極　9　冰水　10　數(shù)字式萬(wàn)用電表

　　3.測(cè)量探極置于同種瓣葉內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)探極插入冰水瓶，測(cè)量?jī)商綐O之間電勢(shì)差，依公式與攝氏溫度換算。根據(jù)復(fù)溫速度要求，將含有同種瓣材料的托盤(pán)，通過(guò)細(xì)繩由旋轉(zhuǎn)升降器牽引上升，利用萬(wàn)用電表顯示電勢(shì)差，控制升降速率。換算公式：U=0.0385t+0.00004t2-5.4295×10-8t3，其中U為電勢(shì)差值(單位：mV)，t為攝氏溫度值(單位：℃)。
　　4.實(shí)驗(yàn)方法?、倥_(tái)盼藍(lán)染色法：0.25%胰酶消化剪碎的主動(dòng)脈瓣葉，270目纖維濾膜過(guò)濾，濾液1200轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清液，按1∶1將5%臺(tái)盼藍(lán)加入細(xì)胞懸液，光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。②葡萄糖代謝率測(cè)定：每10mg瓣膜組織中加入RPMI1640液1ml，在37℃、5%CO2孵箱中孵育24小時(shí)后用自動(dòng)生化分析儀作葡萄糖定量測(cè)定。代謝率［mmol/(mg．24h)］其中RPMI1640液原液同條件下葡萄糖定量為11.3mmol/L。③氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入量：瓣葉組織在孵育中加入3H-TdR 2μci，24小時(shí)后取出瓣葉，經(jīng)漂洗后加入2mol/L NaOH，加熱將其溶解，加入閃爍液10ml，用自動(dòng)液閃計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)(CPM)。3H-TdR參入量［CMP/(mg．24h)］=，其中RPMI1640原液本底為27CPM。④組織培養(yǎng)：以組織塊貼壁方法在37℃、5%CO2孵箱中RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每周換液2次，每次半量，待組織塊周邊有細(xì)胞長(zhǎng)出后，拍照。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法　臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞百分率行組間χ2檢驗(yàn)，葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量以Image12.gif (851 bytes)±s表示，行組間t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有顯著意義。

結(jié)　果
　　臺(tái)盼藍(lán)拒染細(xì)胞百分率、葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示：Ⅱ～Ⅵ組活細(xì)胞百分率(主要為內(nèi)皮細(xì)胞)顯著低于Ⅰ組(P＜0.05)；而Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)；Ⅰ組葡萄糖代謝率、3H-TdR參入量顯著高于其它各組(P＜0.05)，Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P＜0.05)。組織培養(yǎng)Ⅰ組細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)于其余各組，且早3～4天。Ⅱ～Ⅵ組培養(yǎng)，Ⅳ組細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組。

討　論
　　同種瓣形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整決定著其耐久性。瓣膜冷凍保存不同于單細(xì)胞，由于細(xì)胞成分多樣，細(xì)胞間質(zhì)存在，在復(fù)溫過(guò)程中，使熱量交換不均勻，外周組織內(nèi)冰晶融化可從內(nèi)部吸收熱量，使內(nèi)部組織再結(jié)晶加重，可造成細(xì)胞嚴(yán)重的機(jī)械性損傷。另外，低溫蛋白質(zhì)的變性，脂質(zhì)的丟失，細(xì)胞膜通透性的改變以及細(xì)胞膜上小孔的形成，使水分子易通過(guò)細(xì)胞膜，引起細(xì)胞內(nèi)水負(fù)荷加重，超過(guò)一定時(shí)間或程度時(shí)，細(xì)胞便會(huì)破裂。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同復(fù)溫速率對(duì)液氮保存的同種瓣均有損害。臨床上常用的42℃水浴復(fù)溫法，其復(fù)溫速率不均勻，細(xì)胞損害重，活性低，可能與細(xì)胞再結(jié)晶重，高水負(fù)荷狀態(tài)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)。30℃/min和10℃/min復(fù)溫，溫差大，細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶重。1℃/min復(fù)溫，雖然再結(jié)晶輕，但細(xì)胞內(nèi)高水負(fù)荷持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞損害亦重。4℃/min復(fù)溫方法較好地保持了細(xì)胞活性，可能與熱交換時(shí)間充裕，再結(jié)晶輕，細(xì)胞內(nèi)高水負(fù)荷狀態(tài)未超臨界值有關(guān)。自增壓液氮罐