種質資源設施保存之液氮超低溫保存法

種質資源設施保存，是在人工控制環境下排除環境壓力和破壞，有效保存種質材料的最安全的保存方式，它包括種子低溫保存、超低溫保存、種質離體培養保存等技術方法。

下面，液氮罐技術人員就來詳細說一下種質液氮超低溫保存技術。自增壓液氮罐

目前正在深入研究的超低溫保存方法，是長期貯藏種質的保存方法之一。這種方法是將種質材料(包括種子、組織體等)保存在-196℃的液氮環境中，以達到更長期的保持生命力或活力的目的。在液氮(-196℃)溫度下，細胞的生長和代謝完全停止，能安全穩定、節省空間、長期有效地建立起離體基因庫，超低溫保存是長期貯存植物種質的最有效方法，甚至被認為是實現生物種質永久保存的唯一途徑。

種質超低溫保存方法包括將保存材料變溫處理到-196℃條件下，并安全保存;在需要時將超低溫保存種質的材料變溫到常溫條件下并恢復活力(或生命力)等一整套生物技術。

一般來說，它包括以下6個步驟:

(1)前培養:對培養體短期的生長鍛煉處理，使其提高耐液氮保存的能力。

(2)防凍:培養體放入防凍液中，使其細胞降低冰點，減少因形成冰晶可能造成的損傷。

(3)變溫冷凍:按照不同變溫模式降溫冷凍，降溫速度依不同種質材料采用特定的速度。

(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有效低溫環境中，以防止冰的游移或解體。

(5)解凍：一般認為快速解凍更好。從液氮環境中取出封裝好的材料，與其容器一同放入+40℃的無菌水浴中，直到解凍后才回到室溫下，未封裝的材料放到20～30℃的液體培養基中解凍。

(6)生命力測定:如用TTC染色法等。

種質材料的超低溫保存，傳統的技術有干凍法、預凍法和兩步法，上世紀80年代末和90個代初玻璃化法和包埋脫水法開始應用于植物材料的超低溫保存。

干凍法:利用無菌空氣流、干燥硅膠或飽和溶液表面的氣相等對種質材料進行脫水處理，然后快速將其投入液氮貯存。

預凍法:將種質材料在添加保護劑(如蔗糖、二甲亞砜、甘油等)后置于低溫冰箱或液氮蒸汽箱(-10～-70℃)中冰凍若干小時后投入液氮貯存。

兩步法:種質材料在添加保護劑后，用程序降溫儀以某個速率(每分鐘0.1～0.5℃)降溫至轉移溫度(-40～-70℃)，然后投入液氮中貯存，兩步法較預凍法更為嚴格。自增壓液氮罐

玻璃化法:種質材料用高濃度的復合冰凍保護劑處理后，快速投入液氮貯存，細胞直接用極高濃度的保護劑脫水，在快速降溫時胞內胞外都進入玻璃化態，而不形成冰晶，從而避免了細胞結構的破壞。包埋脫水法:莖尖、分生組織和體細胞胚等種質材料用褐藻酸鈣包埋后，第一階段先在含高濃度蔗糖的培養基中脫水，第二階段用無菌空氣流或干燥硅膠脫水，然后投入液氮貯存。

超低溫保存技術在保存植物花粉、種子和胚、芽、莖尖、愈傷組織和懸浮細胞等方面有應用和報道，目前主要應用在作物、果樹和園林花卉種質資源保存方面，林木種質資源的超低溫保存也有少量報道。