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外周血PBMNC分離及凍存
PBMNC分離效果
按照GMP生產(chǎn)規(guī)范和臨床ACI要求分離外周血PBMNC，冷凍保存前細胞活性為99.6%±0.4%（n=5），與原始血樣比，PBMNC回收率58.4%±6.52%（n=5）。
細菌和真菌培養(yǎng)陰性，實現(xiàn)全程無菌處理。液氮罐
不同冷凍保護液對PBMNC的保護效果不同
PBMNC在－196℃液氮中儲存24個月后復(fù)蘇，鏡下觀察見細胞形態(tài)完整，圓形飽滿，PBMNC復(fù)蘇效率89.7%±3.82%，凍存液中含80%無血清培養(yǎng)基組和含80%自體血漿組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05）（表1）。
PBMNC凍存后誘導(dǎo)
AIL細胞的體外增殖及表型分析在倒置顯微鏡下觀察顯示，外周血單個核細胞呈懸浮生長，大小均勻，折光性一致，AIL經(jīng)4d培養(yǎng)后部分細胞明顯增大，可見細胞集落，胞核密度加強，體積增大，胞膜光滑，未見突起，新鮮與凍存后的單個核細胞誘導(dǎo)的AIL在形態(tài)和表型上無明顯差別，增殖高峰期均在10－12d。
在培養(yǎng)過程中第14天，凍存組AIL細胞所占相對百分率由約2.3%上升約為10.4%，細胞數(shù)增加約1048倍，對照組AIL所占相對百分率由約2.3%上升為約11.3%，細胞數(shù)增加約1105倍。兩組之間在細胞增長倍數(shù)與AIL所占百分比無顯著差異（P＞0.05）。
（表1）
效應(yīng)細胞的體外細胞毒活性
新鮮的與凍存的單個核細胞誘導(dǎo)的AIL對NK敏感（K562）或非敏感株細胞（HeLa）及貼壁或懸浮生長的腫瘤細胞均顯示出很強的殺傷活性，且該活性隨效靶濃度比的增加而增大，兩組間的細胞毒活性無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。液氮罐
圖2：比較各種冷凍和對照組之間的增殖和細胞表型。A：所有表型培養(yǎng)前。B：所有在冷凍組表型培養(yǎng)14 天后。C：所有對照組表型培養(yǎng)14 天后，D：所有增殖。E：自體免疫淋巴細胞。
（表2）
