精子冷凍保存技術的發展

精子冷凍保存技術的發展為珍稀、經濟魚類種質資源的保存提供了一條有效的途徑，目前精子冷凍保存已經被利用到農業、畜牧、醫療、科研等生物技術相關領域，國內開始對魚類精子進行冷凍保存研究始于上世紀80年代，到目前為止已經對30多種海淡水魚類精子進行了冷凍保存研究，但國內在淡水水域冷水魚類精子冷凍保存方面的研究較少，目前僅對江鱈（Lotalota）和白斑狗魚（Esoxlucius）精子冷凍保存技術進行了研究。氣相液氮罐

鮭鱒魚類為國際上冷水魚類養殖的主要品種，對于其種質資源的保存研究被廣泛受到重視。Merino等利用1%BSA+40%精漿對虹鱒精子首次進行了玻璃化冷凍保存，獲得了81%的成活率。研究了冷凍對虹鱒精子核DNA穩定性和后代發育的影響，有專家認為冷凍對精子質量沒有造成明顯的影響，外部抗凍劑可提高虹鱒精子細胞膜的穩定性。Gallant等利用不同的稀釋液對大西洋鮭精子進行了冷凍保存，發現0.137mol/LNaCl、0.011mol/LKCl、0.004mol/LNa2HPO4·7H2O、7.5g/LL-α-卵磷脂和12%DMSO可以明顯地降低不成活精子比率。Kusuda等認為，分別利用10%的甘油、二甲基亞砜與90%的小牛血清（FBS），10%甲醇與90%300mmol/L葡萄糖配制成混合液，適合于冷凍保存庫頁島哲羅鮭（Huchoperryi）精子。

利用9種精子稀釋液冷凍保存哲羅鮭精子，僅在ELS和D15中發現有成活的精子，但是成活相當低，利用ELS為稀釋液，對甲醇和二甲亞砜的濃度進行調整和篩選，發現6%的甲醇冷凍精子的活力較高，而二甲基亞砜冷凍精子成活率極低。再利用D15為稀釋液對其中葡萄糖濃度進行篩選，當葡萄糖濃度為30%（D30）時冷凍精子成活率較高。研究結果顯示，一定濃度甲醇和葡萄糖有利于哲羅鮭精子冷凍保存，但是冷凍保存后精子活力與鮮精相比下降太多。主要原因可能與冷凍保存體積有關，利用2mL冷凍管作為精子容器，主要目的是研究哲羅鮭精子大量冷凍的技術方法，而目前報道的鮭鱒魚精子冷凍保存大都利用250μL小體種積麥管做為冷凍精子容器，麥管貯藏體積小，保存精子量少，不利于魚類大量精子冷凍保存與應用（Drokinetal.,1998;Merinoetal.,2012）。冷凍管體積較大，可以大量的冷凍保存，在海水魚類精子冷凍中被廣泛應用，但在冷水魚中未有應用報導。因此對于哲羅鮭精子的大量冷凍保存還有待于對其冷凍方法做進一步的研究。

在魚類人工繁殖和實際生產中，經常遇到養殖場技術人員將采集的大量魚類精子直接放置在4℃冰箱，或者將精子容器放置在事先準備好的冰桶中，這樣魚類精子可以維持數小時到十多小時的活力，以這樣方法來彌補和解決雌雄魚成熟不同步的問題。但是當原精直接暴露在空氣中時，由于受到環境溫度、水分蒸發、氧化、蛋白質變性等多種因素的影響，使精子活力迅速降低，影響受精的效果。由于大部分養殖公司都不具備精子冷凍保存的設備和技術，所以精子的短期冷凍保存在一定程度上能夠暫時解決精子的應用問題。龔麗等對二倍體和三倍體虹鱒精子短期冷凍保存進行了研究，原精液在4℃下可保持活力達5~12.5d。連晉和王拴文利用人工精漿稀釋虹鱒精液并低溫保存可將精子保存到60d。本研究利用4種不同稀釋液（D15、D30、Stein和ELS）對哲羅鮭精子進行稀釋后放置在2~4℃的保溫盒中保存，精子在Stein和D30中保存時間較長，說明這兩種稀釋液的滲透壓及溶液成份為精子的短期保存提供了較適宜的外部環境，研究結果為哲羅鮭精子的短期低溫保存和應用提供了一定的技術基礎。
氣相液氮罐
研究發現，ELS和D30兩種稀釋液分別加入6%甲醇冷凍保存哲羅鮭精子具有一定的活力，30%的葡萄糖有益于提高精子活力，二甲基亞砜不適于冷凍保存哲羅鮭精子。本研究為我國珍稀冷水魚類哲羅鮭精子冷凍保存技術及精子冷凍庫的建立提供了一定的技術依據，但大量冷凍保存精子活力較低，因此哲羅鮭精子的大量冷凍保存技術還有待進一步完善。